中国·金沙-www.9170.com|登陆入口

关于流式定量MESF / QSC kit的样本落在标曲外的问题回复

2026-04-06

最近,不少客户反映在使用MESF或QSC 试剂盒时,样品的测量值在标曲范围以外。该如何解决,现回复如下。
对于MESF kit 来讲,有两类荧光,一种是蛋白荧光(PE及APC),一种是传统的荧光(FITC,AlexFluo488及647)。二者的差别,不仅是量子产率上,而且还有分子量大小的差别。PE及APC的物理尺度在数个纳米甚至10多个纳米,而FITC及AlexFluo(AF)的大小不到1个纳米。 也就是说,在球体一定的情况下,可掺入球体的FITC及AF分子数比APC及PE 要多很多,而且作为蛋白,APC及PE是无法内染的,只能是接在微球的表面,这进一步限制了其分子数。也就是说,PE及APC kit的标曲范围不会很宽。
因此,尽管对于APC及PE来讲,它们的荧光很亮,对表达量少的样品非常适合,弱表达也能得到很强的荧光信号,但对高表达的样本,可能就不太合适了,特别是那些本身比较大的细胞,如巨噬细胞。此时,我们建议选AF488或647 kit。
QSC kit 是用二抗来模拟抗原的,但它毕竟与样本的真实抗原有差别。更重要的是二抗本身的分子量就比较大,也就是说就算是饱和偶联,球体表面也容不下太多的二抗分子。比如某个样本的抗原,如果其分子小,表达量高,完全就有可能超过QSC kit中4号球的值,最后的结果是值在标曲范围外,此时,我们建议您选择MESF kit,可能更合理。

此外,若样本数值已经超出最高或最低标准品的范围,流式细胞术文献中通常会采用外推法进行处理,而QuickCal模板会自动执行这一操作。

此外多说一句,Spherotech的Calibration kit (如8峰球),原理上也是可以用来做流式定量的。但是有一个问题,Spherotech的具体荧光物质是保密的,用FITC通道校准的荧光,可能不是FITC, 而是一个与FITC相近的荧光。比如PE通道,它的8峰球也是可以做线性的,但是spherotech的球是Hard dyed(即内染的),所以根本不可能是PE蛋白(蛋白不能内染) ,如果我们此时用PE标记的抗体去定量,中间会产生误差。

References:

1 Kondratov, K., Nikitin, Y., Fedorov, A., Kostareva, A., Mikhailovskii, V., Isakov, D., Ivanov, A., & Golovkin, A. (2020). Heterogeneity of the nucleic acid repertoire of plasma extracellular vesicles demonstrated using high‐sensitivity fluorescence‐activated sorting. Journal of Extracellular Vesicles, 9(1), 1743139. https://doi.org/10.1080/20013078.2020.1743139

2 Mizutani, K. (2007). The Importance of Anti-HLA-Specific Antibody Strength in Monitoring Kidney Transplant Patients. American Journal of Transplantation, 7, 1027-1031. 

3 Pevna, M. (2014). Residual Cancer Lymphocytes in Patients With Chronic Lymphocytic Leukemia After Therapy Show Increased Expression of Surface Antigen CD52 Detected Using Quantitative Fluorescence Cytometry. Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia, 14(5), 411-418. 

4 Thedsawad, A. (2011). Development of flow cytometry for detection and quantitation of red cell bound immunoglobulin G in autoimmune hemolytic anemia with negative direct Coombs test. Asian Pac J Allergy Immunol, 29, 364-367.

 

上一篇

技术 技术

技术

59870

QQ QQ

QQ

QQ:1279306

微信 微信

微信

微信
微信

返回顶部